Инга Валерьевна Назарова: «Наша глобальная задача – сделать раннюю диагностику максимально простой»

Разработка методов ранней диагностики рака – задача, над которой бьются ученые по всему миру. Ведь выявление онкозаболеваний на ранней стадии позволит существенно снизить смертность. О работе лаборатории субклеточных технологий НМИЦ им. Петрова мы поговорили с Ингой Валерьевной Назаровой – научным сотрудником и одним из авторов научного проекта по ранней диагностике колоректального рака.

– Объясните, пожалуйста, чем занимается биолог в медицинском учреждении? Какие задачи перед ним стоят?

– Медицина – это практическая деятельность, и фундамент медицины – это биология. Строение организмов, функции различных органов, реакция клеток на те или иные стимулы и так далее – это все изучает биология. Кроме того, все лекарственные средства вовлекаются в биохимические процессы внутри организма. И, кстати, любые разработанные препараты требуют фундаментальных биологических исследований. В этом как раз таки помогает биология. Биологи изучают воздействие лекарств на различных биологических моделях – мышах, крысах, рыбах, клеточных культурах, выращенных из образцов человеческой ткани. Также биологи помогают разрабатывать новые методы лечения и диагностики. Моя деятельность направлена именно на последнее направление – диагностику.

– Инга Валерьевна, как вы пришли к решению стать биологом? Почему вас заинтересовала эта наука?

– Ещё в дошкольном возрасте во время прогулок я с интересом разглядывала окружающий мир: луга, букашек, лягушек. Наверное, меня поражало такое многообразие жизненных форм в природе. С той поры родители стали поощрять мой интерес и приобретали различные энциклопедии о растениях и животных. В средней школе я заинтересовалась естественно-научными предметами и начала углубленно изучать разделы биологии, которые детально описывают жизненно важные механизмы: клеточная биология, генетика, микробиология.

Чтение книг привело меня к участию в олимпиадах. Уже к 11 классу я твердо решила поступать на биофак СПбГУ. Биология – одна из самых быстро развивающихся наук. Её прелесть в том, что можно рассматривать любой живой организм – будь то водоросль, мышь или человек – на разных уровнях организации жизни: от молекул до целого организма. Биология включает в себя множество научных разделов, она многогранна и рассматривает абсолютно непохожие друг на друга организмы. Здесь нет единых универсальных подходов к изучению объекта, как в химии или физике. И именно этим она интересна.

– Биология – всеобъемлющая наука, выбор дальнейшей профессиональной деятельности был широким. Почему вы решили работать именно в сфере медицины?

– В университете каждый студент биофака мог выбрать любое из трех направлений: биоразнообразие, физиологию, клеточную и молекулярную биологию.  Я выбрала последнее. Специализация на клеточной и молекулярной биологии открывает хорошие перспективы для работы, в том числе позволяет подготовиться к деятельности в области биомедицины. Медицина – практическая дисциплина, требующая большого багажа знаний и навыков. После окончания университета я стала работать специалистом по оборудованию и реагентам для проточной цитометрии в области онкогематологической диагностики.

– Проточная цитометрия – это метод исследования, благодаря которому можно измерять оптические параметры большого числа объектов, размер которых сопоставим с размерами клетки. В случае работы с клетками метод позволяет детектировать, то есть находить, определенные белки и молекулы на поверхности и внутри клеток, а также получать качественный и количественный анализ популяции интересующих нас клеток. Такой «популяционный» анализ нельзя провести с помощью обычного микроскопа. Поэтому специалист работает на специальном оптическом лазерном оборудовании – проточном цитометре. Чтобы провести анализ, необходимо добавить к исследуемому образцу, биологической жидкости или суспензии клеток антитела к интересующим нас антигенам. С течением времени они образуют комплекс на поверхности исследуемого объекта, то есть антитела сцепляются с антигенами. На поверхности комплекса имеются соединения – флюорохромы. Когда исследуемая жидкость пропускается через цитометр, она освещается лазером, и флюорохромы возбуждаются. Прибор считывает сигнал и оцифровывает его. Задача специалиста – правильно подобрать антитела, подготовить пробы, настроить оборудование, проделать все манипуляции, а потом расшифровать этот оцифрованный сигнал – по графикам на компьютере определить все количественные и качественные характеристики клеток. Благодаря проводимому цитометрическому исследованию, можно понять, какие изменения происходят в изучаемом или исследуемом нами объекте, а значит, и в организме.

– Как вы пришли работать именно в медицину? У вас выбор, наверное, был более широкий.

– Во время работы специалистом по проточной цитометрии я также помогала медицинским работникам составлять протоколы подготовки проб, то есть разрабатывать инструкции по подготовке биологического материала непосредственно к анализу – какие реагенты нужно добавлять. Это меня особенно заинтересовало, захотелось поучаствовать в фундаментальных медицинских исследованиях. Коллеги рассказали, что в НМИЦ онкологии требуется специалист моего профиля. Я прошла собеседование и стала сотрудником Центра.

– Получается, вы резко перешли от клинических задач к научным проектам.

– Нет, на самом деле моя работа на стыке клиники и науки. Наша лаборатория не занимается фундаментальными исследованиями, мы разрабатываем технологии анализа наноразмерных внеклеточных везикул, то есть так называемые «субклеточные технологии», чтобы потом внедрить их в клинику. Плюс работы в лаборатории в том, что здесь все научные проекты прикладные. Когда мы занимаемся исследованием для медицины, к нам на помощь приходят онкологи с лекциями и презентациями, которые освещают нам суть вопроса, и мы вместе сидим и обсуждаем, что мы хотим получить. Как нам реализовать задуманное исследование с разных сторон – медицинской и научной. Это помогает двигаться в правильном направлении.

– Чем сейчас занимается лаборатория субклеточных технологий?

– В широком смысле мы разрабатываем методы ранней диагностики рака. Это сыграет большую роль в жизни людей, потому что ранняя диагностика позволяет более эффективно провести лечение, снизить показатели смертности и увеличить уровень жизни пациентов. Наша глобальная задача – сделать раннюю диагностику максимально простой, требующей наименьших затрат человеческих ресурсов и наименьшего вмешательства в организм человека. Чтобы выполнить эту задачу, мы изучаем свойства нановезикул или по-другому экзосом – пузырьков наноразмеров, которые секретируют все клетки организма человека. Они нужны для межклеточного общения, то есть клетка А хочет передать сигнал клетке Б, и для этого она секретирует нановезикулу, которая добирается до клетки Б через биологические жидкости, в частности, и через кровь. Особенность этих микропузырьков заключается в том, что каждый из них, по сути, является отпечатком родительской клетки, то есть имеет такой же биохимический состав и может многое рассказать о ней. Это уникальное свойство позволяет нам изучать их подробно. Вот нас, как ученых  онкологического центра, интересуют больше всего нановезикулы, которые вырабатываются раковыми клетками.

– А чем занимаетесь лично вы? В чем заключается ваша работа в научном коллективе?

– Когда я пришла в НМИЦ онкологии, перед научной группой была поставлена задача – разработать метод ранней диагностики колоректального рака. Нельзя говорить лично о чьей-то работе, ведь мы все работаем в связке, каждый сотрудник – специалист в своей области, но над научными проектами мы работаем вместе.

– Пока что диагностика колоректального рака производится с помощью различных эндоскопических методик, а это очень неприятно для пациента, поэтому многие люди стараются избегать эндоскопии, ФГДС и прочего, лишь бы не испытывать дискомфорт. Поэтому ученые во всём мире разрабатывают методы диагностики колоректального рака, основанные на выявлении каких-нибудь циркулирующих элементов в плазме крови. То есть чтобы можно было по анализу крови выявить опухолевый процесс.

– Расскажите, пожалуйста, подробнее об этом научном проекте. Как ведется работа?

– Мы ведем работу по этому направлению уже более двух лет. Это сложный многоэтапный проект. Если отталкиваться от того, что мы изучаем нановезикулы, то в этом проекте нам нужно было, во-первых, обнаружить нановезикулы, которые секретируются клетками эпителия кишечника, во-вторых, понять, как именно обнаружить опухолевый процесс, то есть какие молекулы смогут рассказать нам о развитии злокачественного новообразования. Мы предположили, что если везикулы, секретируемые клетками определенного эпителия, «несут» специфические именно для этого эпителия маркеры, то повышение их концентрации в плазме крови может отражать метаболическую или пролиферативную активность клеток этого эпителия и отражать процесс образования эпителиальной опухоли или рака. Мы начали с молекул. Изучили научную литературу, открытые базы данных (The Protein Atlas, например) и выбрали протеины, которые  экспрессируются только клетками кишечного эпителия. То есть существует чуть более 20 молекул, которые могут вырабатываться только в кишечнике, а в других органах – нет. Далее нужно было проверить эту информацию, и на этом этапе нам понадобилась помощь наших коллег из лаборатории патоморфологии. Для этого мы взяли биологические образцы тканей нормального кишечного эпителия, оценили их белковый состав и наличие интересующих нас молекул. Затем исследовали уровень экспрессии этих молекул уже на клеточных культурах – стабильных линиях клеток колоректального рака. И в заключении оценили факт наличия потенциальных «маркеров» кишечного эпителия в составе везикул, секретируемых клетками колоректального рака в условиях in vitro. Анализ полученных результатов позволил выбрать молекулы, во-первых, специфичные для клеток кишечного эпителия, и во-вторых, присутствующие в составе везикул, секретируемых этими клетками. Так наш круг сузился до 8 молекул.  Можно было предполагать, что их концентрация у пациентов с колоректальным раком выше, чем у здоровых доноров. То есть именно эти 8 молекул могут рассказать нам о наличии опухолевого процесса в организме. Но это предположение требовало проверки.

– Почти. В плазме крови, помимо воды, основных белков плазмы: альбумина, глобулинов, присутствуют различные биологические активные вещества и везикулы. Среди последних – фракция экзосом – нановезикул, которые попадают в плазмоток из клеток различных тканей. Клетки синтезируют везикулы, «отражая» в них свой биохимический состав. Соответственно, эти нановезикулы могут иметь диагностический потенциал.

Мы взяли две выборки людей – здоровых доноров и пациентов с 4 стадией колоректального рака, в плазме которых мы предполагали найти повышенную концентрацию везикул с «кишечными» маркерами. В каждой группе было по 30 участников.

В нашем исследовании мы двигались «от общего к частному»: сначала нужно было выделить общую популяцию нановезикул, а затем – специфическую популяцию везикул, то есть везикулы, которые «несут» на поверхности «маркеры» эпителия кишечника. Именно на этом этапе нам необходимы были эти 8 молекул, перечень которых мы определили ранее.

Чтобы выделить из тотальной фракции везикул только специфичные для тканей эпителия кишечника, мы разработали технологию, основанную на феномене иммуносорбции. Мы создаем иммунные комплексы из супер-парамагнитных частиц, меченых белком стретавидинином, которые могут связаться с антителами, специфическими к «кишечным» маркерам. При этом антитела мечены биотином. За счет образования связи биотин-стрептавидин образуются иммунные комплексы, которые мы инкубируем с выделенной из образцов крови тотальной фракцией нановезикул. За счет специфического взаимодействия антител в составе иммунных комплексов и белков в составе везикул происходит иммуносорбция специфической фракции везикул. Затем мы детектируем эти везикулы с помощью других антител, специфичных к так называемым «везикулрным» маркерам и меченых флурохромом. Оценку результатов проводим с помощью проточной цитометрии: регистрируем сигнал флуоресценции от каждого события – комплекса супер-парамагнитной частицы с антителами и нановезикулами. Собираем данные, проводим статистический анализ полученных данных для выявления действительно значимых для диагностики молекул.

Мои знания методики проточной цитометрии и опыт прежней работы были востребованы в ходе разработки и оптимизации описанной технологии. Чтобы выделить и количественно оценить из тотальной фракции везикул только «кишечные», мы разработали методику формирования иммунных комплексов. Размер везикул ниже порога чувствительности цитометра. Поэтому наша технология решала две задачи: специфической сорбции «кишечных» везикул и фиксации их на относительно больших, т.е. «видимых» для цитометра, супер-парамагнитных частицах. Для этого используем магнитные частицы, которые имеют размер около 5 микрон, несут на своей поверхности белок стрептавидин и могут соединяться с антителами, специфично связывающих молекулы – ранее выбранные маркеры кишечного эпителия. Так образуются иммунные комплексы. Далее проводим еще несколько манипуляций: «отмываем» комплекс от «лишних» и неспецифично связавшихся с ним везикул или других компонентов плазмы и метим каждый комплекс, состоящий из магнитных частиц, антител и везикул. При этом используем антитела к общим маркерам везикул, что обеспечивает дополнительный уровень специфичности метода в целом: визуализируются только везикулы, но не другие компоненты плазмы, которые могли адсорбироваться на поверхности иммунных комплексов. Каждый этап технологии требовал контроля его эффективности и специфичности,  оптимизации в ходе многократных экспериментов. Затем использовали оптимизированный протокол для исследования образцов плазмы пациентов и доноров, проводили подсчет и анализ данных, полученных с помощью цитометрии. И получили результаты: если концентрация этих 8 молекул высока – можно говорить об опухолевом процессе, если низкая – человек здоров. В будущем, возможно, этот круг можно будет сузить до 3 молекул, но это потребует новой оптимизации процесса анализа и разработки алгоритма интерпретации полученных данных. Одной из основных задач проекта было создание вот этого самого иммунного комплекса, который позволит выделить и «подсчитать» наличие в плазме крови везикул, секретируемых клетками кишечного эпителия. И она уже решена.

– У вас было много неудач и попыток во время этих двух лет исследования?

– Сначала ничего не получалось, потому что мы смотрели молекулы на поверхности клеток, и там совсем были мизерные проценты, потом я догадалась посмотреть, а что внутри клеток, взглянуть с другой стороны на этот объект. И тогда наша научная работа начала получаться. Мы поняли, что молекулы-онкомаркеры не на поверхности, а внутри клеток. И соответственно, они могут быть в составе нановезикул, которые секретируются клеткой «изнутри наружу».

– Потенциально результаты этого научного проекта могут быть внедрены в практику?

– Да, но нам предстоит еще много работы – как научной, так и клинической. Промежуточные результаты нашего исследования я представила в формате постерного доклада на Международном конгрессе ESMO World Congress on Gasctrointestinal cancer. Этот конгресс проведен Европейским обществом медицинской онкологии ESMO в онлайн-формате с 30 июня по 03 июля 2021 года.  Тематика конгресса затронула вопросы диагностики, терапии, изучения молекулярно-биологических механизмов развития опухолей желудочно-кишечного тракта. Конгресс предполагал формат онлайн-презентаций новейших исследований, проводимых учёными и клиницистами во всем мире. В моем постере были представленные последние, ещё тогда не опубликованные в научном журнале результаты исследований, касающихся разработки нового метода диагностики колоректального рака на основе оценки уровня экспрессии тканеспецифических маркеров на поверхности циркулирующих в плазме нановезикул. Предварительные результаты проекта по разработке метода диагностики колоректального рака были опубликованы в журнале «Колопроктология» в прошлом 2020 году, в августе 2021 года вышла статья с подробными результатами исследования в международном научном журнале Cancers/MDPI.

– Как вообще происходит реализация научного эксперимента в области биомедицины?

– Важная исходная точка научного эксперимента – постановка вопроса или формулировка проверяемой гипотезы. Гипотеза может быть нулевой, когда нет разницы между исследуемыми группами, и альтернативной – когда есть разница между исследуемыми группами. Важный предмет при изучении гипотезы – предполагаемая причинность: изменяется, по крайней мере, один независимый параметр, и изучается его влияние на зависимую переменную. Для оценки причинно-следственной связи мы подбираем различные условия: время воздействия веществ, концентрацию этих веществ, разбираем биологические механизмы, вовлеченные в конкретный процесс. Можем моделировать условия как хотим. Экспериментальная проверка приводится на различных биологических моделях: клеточные культуры, лабораторные животные, выделенные биологические образцы, будь то соскоб, плазма крови или другое. Если гипотеза верна, то мы уже начинаем более подробно изучать, проверять её и подтверждать. Так возникают теории. Объем выборки исследуемых групп тоже играет большую роль в исследовании – он позволяет узнать, насколько статистически значимые результаты. Правильный дизайн или по-другому план исследования гарантирует как можно меньше помех при получении результатов. Мы должны базироваться и на данных из литературы, разобрать все плюсы и минусы данной методики. Итогом исследования становится оценка полученных данных и сравнение с результатами других исследований, опровержение или доказательство научной гипотезы.

– А как проводится работа внутри вашего научного коллектива?

– Сначала мы собираем и анализируем информацию из научных статей. Нельзя игнорировать результаты предыдущих экспериментов. К тому же биология быстро развивается, потому мы досконально изучаем, сравниваем, компилируем протоколы и технологии, которые описаны в опубликованных исследованиях. Изучаем инструкции по применению различных реагентов, используемых в этих методиках, иногда сотрудничаем с разработчиками или производителями новых исследовательских технологий, это помогает оптимизировать наши исследования. После сбора и анализа прочитанного мы планируем эксперименты, обсуждаем условия их выполнения: делимся своими идеями, даем друг другу рекомендации. В сборе биоматериала для экспериментов нам помогают коллеги из клинических подразделений нашего центра или других лечебных учреждений. Например, этот проект выполняется в тесном сотрудничестве с НМИЦ колопроктологии им. А.Н. Рыжих в Москве. Далее самостоятельно ставим эксперименты с учетом обсуждения, а также корректировок в текущий момент и измеряем определенные параметры: количество, концентрацию нановезикул, состав белковых молекул, микроРНК. Мы детектируем или не детектируем изменения – количественные, качественные характеристики – в различных пробах. Проводим сбор результатов, их статистическую обработку с помощью программного обеспечения, составляем лабораторный отчет. В лаборатории работают биологи, химики, физики, биотехнологи, т.е. коллектив лаборатории имеет широкий спектр компетенций, что очень помогает в разработке новых технологий. Так мой опыт специалиста в области проточной цитометрии был необходим в моей работе и был также востребован в других проектах. У каждого сотрудника есть один или два «своих» проекта, но технологические задачи обычно решаем вместе, сочетая разные компетенции. Это  необходимое условие эффективных разработок. Каждое утро начинаем с оптимизации планов на день с учетом использования приборов, а раз в неделю проводим внутрилабораторные собрания, на которых обсуждаем результаты и текущие дела. Это полезно, ведь можно собрать полученные цифры, иллюстрации уже на промежуточных этапах всего эксперимента, обсудить с коллегами, найти ошибки, спланировать следующие шаги. Когда разработанные технологии начинают «уверенно работать» – мы их патентуем, а когда полученные научные результаты «складываются» в наукоемкие истории – пишем научные статьи в специализированные журналы.