Генетик Владислав Ильич Тюрин: «Эволюция опухоли в ходе лечения, разработка и использование новых подходов для помощи онкобольным напоминают гонку вооружений»

Научная лаборатория молекулярной онкологии НМИЦ им. Н.Н. Петрова специализируется на генетических исследованиях опухолей человека. Коллектив, возглавляемый членом-корреспондентом РАН, профессором Евгением Наумовичем Имянитовым, автором научных открытий и целого ряда современных диагностических методик, ведёт как фундаментальные, так и прикладные исследования в области диагностики и лечения рака.  О своей исследовательской работе и новых разработках лаборатории, о том, чем генетика привлекает молодых учёных разных специальностей, мы поговорили с врачом-лабораторным генетиком Владиславом Ильичом Тюриным.

 – Владислав Ильич, как вы пришли в профессию?

– С детства меня интересовал широкий круг проблем. В школе нравились почти все предметы, было тяжело выбрать что-то одно. Я учился в лицее города Кириши в естественнонаучном классе.

Киришский лицей окончил в 2009 году, тогда впервые ввели обязательное ЕГЭ, и не было ограничений по количеству подаваемых заявлений в разные вузы. Я сдал много экзаменов: физику, математику, биологию, русский, обществознание и жалел, что не сдавал географию, так как метеорология мне тоже тогда казалось интересной. Поступал сразу на несколько абсолютно разных специальностей: от подводных нефтегазовых сооружений до санэпидемиологии, программирования и биомедицинского приборостроения. Мне нравился стык разных наук, направлений – медицины, биологии, физики и современных информационных технологий.

Я узнал, что в Санкт-Петербургском педиатрическом медицинском университете (СПбГПМУ), на тот момент ещё в академии, объявлен первый набор на новую специальность – медицинская биофизика. До этого она была всего в нескольких вузах Москвы и Томска. Мне она показалась очень перспективной, таких специалистов мало. В то время много говорилось о модернизации и инновациях в медицине, о востребованности специалистов по МРТ, КТ, генетике.

– Чем занимаются врачи-биофизики?

– Врачи-биофизики – это будущие врачи-исследователи, диагносты, которые могут работать на сложном оборудовании. Обучение длится шесть лет, после этого – ординатура. Однако, как оказалось, в своем выборе постдипломного образования (ординатуры) я как медицинский биофизик был существенно ограничен. На тот момент, в 2015 году, можно было выбрать среди диагностических специальностей, таких как лучевая диагностика, радиология, функциональная диагностика, а также стать врачом-вирусологом, микологом, микробиологом, лабораторным генетиком и врачом клинической лабораторной диагностики.

За время обучения в университете у нас, как у биофизиков, были клинические предметы, но далеко не все, зато в отличие от коллег у нас были такие дисциплины, как кибернетика, медицинское приборостроение, большой курс генетики с практическими занятиями. Также два года нам преподавалась высшая математика (математический анализ, статистика) и полтора года – физика. Обычно в медицинских институтах этому выделяется всего один семестр.

Дополнительно нас учили на более глубоком уровне понимать физические принципы позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), компьютерной томографии (КТ), магнитно-резонансной томографии (МРТ), чтобы мы в будущем могли эффективно решать научно-практические задачи.

– Как вы попали в научную лабораторию молекулярной онкологии НМИЦ?

– Когда я учился на третьем курсе, сестра моей бабушки заболела раком поджелудочной железы, и я глубоко погрузился в данную проблему. Так получилось, что в тот момент в университете мы изучали патологическую физиологию, и среди преподавателей был Александр Петрович Трашков. Он в тот момент работал ещё и в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова. Александр Петрович увлекательно и подробно рассказывал про ключевые черты рака, можно сказать, что мы с ним разобрали серию статей («Hallmarks of Cancer» и «Hallmarks of Cancer: The Next Generation») докторов Douglas Hanahan и Robert A. Weinberg, которые описывают молекулярные механизмы развития рака. Чуть позднее в рамках студенческого научного общества (СНО) я стал посещать научную лабораторию молекулярной онкологии НМИЦ онкологии им. Петрова, которая является научно-практической базой кафедры генетики педиатрического университета, а затем через год я стал работать здесь уже в качестве лаборанта.

На шестом курсе университета передо мной встал выбор дальнейшей специализации, формы и места обучения. Я узнал о конкурсе Future Biotech для молодых учёных и решил попробовать принять в нём участие. Главной наградой для лучших участников являлась возможность стать слушателем недельной школы биотехнологий в Москве. Я прошел конкурсный отбор и стал студентом курса. Занятия были интенсивные, лекции читали российские и иностранные специалисты. Среди участников были ученые, работающие в разных биомедицинских направлениях – клиницисты и фундаментальные учёные: биологи, фармакологи, физики. Участие в школе позволило мне поверить в свои силы, избавиться от комплекса нехватки знаний по смежным дисциплинам. Я понял, что все мы, специалисты разных профилей, кусочки единой мозаики современной медицины и биотехнологий, дополняющие своими компетенциями и знаниями друг друга. Решил, что хочу и дальше развиваться в данной области, приносить пользу онкологическим пациентам. Так что конференция сыграла роль в выборе моего профессионального пути. Я продолжил  работать лаборантом-исследователем в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова при этом обучаясь в ординатуре в педиатрическом университете по специальности «Лабораторная генетика». Затем поступил в аспирантуру нашего Центра на направление «Клиническая медицина» по специальности «Онкология». Для врача-исследователя необходимо подтверждать свою научную квалификацию, наличие ученой степени является необходимым критерием для участия во многих грантовых конкурсах, а также она дает возможность быть руководителем исследовательского проекта.

Моя дипломная работа в университете была связана с разработкой скринингового метода диагностики ALK-транслокаций (вид генетических нарушений) в опухолях легкого. Диссертационная работа «Изучение предиктивных молекулярно-генетических маркеров эффективности терапии рака легкого», которую я буду защищать 16 ноября, также связана с изучением транслокаций, однако она посвящена изучению перестроек сразу трёх генов ALK, ROS1 и RET.

Вы начинали как лаборант-исследователь, какие функции в лаборатории выполняете сейчас?

– Сейчас моя основная должность – врач-лабораторный генетик, помимо этого, продолжаю оставаться лаборантом-исследователем.

Основной компонент моей работы — общение с пациентами, консультирование их по поводу проведения молекулярно-генетических исследований. Моя задача – объяснить пациенту, как выполняется генетическое исследование, помочь ему правильно описать проблему и сформулировать цель исследования, если это не сделал врач-онколог. К сожалению, не всегда и не все врачи понимают, что они именно хотят получить в результате от генетического тестирования. Молекулярная диагностика –  это отдельная область, требующая понимания генетических основ и нюансов диагностических методов. Также я занимаюсь молекулярно-генетической диагностикой мутаций, характерных для рака лёгкого, преимущественно это транслокации ALK, ROS1, RET.

Еще одно направление моей деятельности – это работа со студентами, которые приходят к нам в рамках студенческого научного общества (СНО).

Моя научно-практическая деятельность включает в себя разработку новых тестов, проведение исследований и экспериментов в рамках исследовательских проектов, а также участие в написании научных статей с описанием полученных результатов.

– Что входит в сферу ваших научных интересов?

– Преимущественно это работа с молекулярными нарушениями в опухолях легкого, с их резистентными вариантами как первичными, так и после таргетной терапии, а также разработка ПЦР-тестов для диагностики таких генетических нарушений.

Я специализируюсь на выявлении клинически значимых транслокаций в опухолях лёгкого. Качественное и эффективное выявление перестроек – это непростая в техническом плане задача.

При транслокациях происходит обмен участками между генами, вступающими в перестройку. Число возможных компаньонов такого взаимодействия весьма велико, а разрыв может происходить в разных участках гена. В результате комбинирования разных фрагментов получается большое число возможных химерных вариантов перестройки, которые по отдельности сложно детектировать (определять). Подход, позволяющий достаточно просто детектировать практически все варианты перестроек – это использование метода оценки дисбаланса экспрессии концевых фрагментов перестраиваемого гена в комбинации с вариант-специфической ПЦР.

Однако существуют случаи, когда мы видим несбалансированную экспрессию, которая свидетельствует о том, что перестройка крайне вероятно присутствует в опухоли, но известные варианты не выявляются. В таком случае мы применяем таргетное РНК-секвенирование нового поколения (NGS), что позволяет идентифицировать редкие или вообще новые варианты перестроек, которые ранее не были описаны в научной литературе. В моей диссертационной работе представлено несколько таких транслокаций: как варианты известных слияний EML4-ALK, так и совсем неописанные перестройки. К обнаруженному новом варианту перестройки мы можем подобрать праймеры, которые войдут в состав используемого нами теста. Это позволяет нам постоянно увеличивать чувствительность и специфичность наших методов диагностики.

– В чем значимость этой работы для пациентов?

– Рак легкого – это самое распространенное и опасное злокачественное новообразование. Около половины больных на момент постановки диагноза неоперабельны. В таких случаях приходится прибегать к лекарственной терапии. В последние годы особенно показала свою эффективность таргетная терапия. Однако для её назначения необходимо обнаружить молекулярную мишень – мутацию. На сегодняшний день наиболее значимые для больных раком лёгкого следующие нарушения: мутации в генах EGFR (ex19del, L858R, T790M и др.), BRAF (V600E), KRAS (G12C); транслокации с участием генов ALK, ROS1, RET, NTRK1-3; потеря 14 экзона или амплификация гена MET; амплификация гена HER2.

Моя работа и деятельность моих коллег нацелена на оптимизацию диагностики транслокаций и других генетических нарушений. Чем точнее она проводится, тем больше пациентов получат наиболее эффективную таргетную терапию. У некоторых из них до выявления транслокации прогнозируемая продолжительность жизни была полгода – год, но при назначении таргетной терапии она может увеличиться в несколько раз. В частности, у пациентов – суперренспонсеров, которые отвечают на лечение лучше, чем пациенты из среднестатистической группы, она может увеличиться до 10 лет. И это дает больным шанс дождаться появления нового поколения лекарственных препаратов, которые дадут им дополнительные годы жизни. Бывают случаи, когда после медикаментозного лечения опухоль уменьшается, становится возможным хирургическое лечение.

У нас был клинический случай. Пациентка, 29 лет, диагноз «опухоль корня лёгкого», четвертая стадия, неоперабельная. Это именно тот случай, когда заболела молодая женщина никогда не курившая. Выполнили гистологическое исследование, выявили низкодифференцированную муцинозную аденокарциному лёгкого. С помощью молекулярно-генетического тестирования обнаружили ROS1-транслокацию, которая встречается в 2–2,5 % случаев немелкоклеточного рака лёгкого. Пациентке назначили в качестве неоадъювантного (предоперационного) лечения препарат кризотиниб. Каждые три месяца проводилось контрольное КТ-исследование. Через полгода был зафиксирован полный ответ (полный регресс новообразования) по данным лучевой диагностики. После этого наш выдающийся коллега, член-корреспондент РАН, профессор Евгений Владимирович Левченко выполнил ей радикальную операцию. Гистологическое исследование оперативного материала также показало полный патоморфологический регресс опухоли. При этом отдельные опухолевые клетки не были выявлены даже на уровне микроскопии. Мы выполнили генетическое исследование этого образца. В выделенном образце нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) мы смогли выявить исходную мутацию (ROS1-транслокацию), хоть и в малом количестве. Это подтвердило, что часть опухолевых клеток выжила после лекарственной терапии и то, что проведенная операция была необходима. Также это позволило принять решение о назначение пациентке курса адъювантной (послеоперационной) таргетной терапии тем же препаратом – кризотиниб. Последующие контрольные обследования (последнее, о котором я знаю, было через три года после постановки диагноза) не показали никаких признаков за прогрессирование или рецидива заболевания. В таком случае мы можем рассчитывать на полное излечение пациента.

К сожалению, несмотря на высокую эффективность таргетной терапии, встречаются пациенты с резистентностью опухоли к ней.

– Что можно сделать в  случаях приобретенной (вторичной) резистентности?

– Онкология и фармакология не стоят на месте. Разрабатываются новые таргетные препараты и подходы к лечению.

Как, например, в случае с EGFR-мутированным раком лёгкого. Первый разработанный препарат гефитиниб действует на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), активированный в результате чаще всего следующих мутаций – ex19del, L858R. Однако со временем в ходе лечения у таких пациентов развивается резистентность, обусловленная чаще всего появлением другой мутации – T790M или амплификации (увеличения числа копий, сопровождающиеся гиперэкспрессией) гена MET. Сейчас таким пациентам назначают следующую линию таргетной терапии при мутации EGFR T790M – осимертиниб (3 поколение EGFR-ингибиторов), при амплификации гена MET – кризотиниб.

Механизм развития опухолевой резистентности активно изучается, среди известных причин резистентности ALK-мутированных опухолей –  это возникновение точковых мутаций в киназном домене гена ALK, амплификация гена MET. Причём спектр появляющихся мутаций зависит от используемого таргетного препарата, при этом мутации могут быть чувствительны к другому уже существующему препарату.

Хочу заметить, что для мутаций EGFR и ALK на данный момент уже существуют три поколения таргетных препаратов, а в каждом поколении имеется несколько представителей. Если выйти за границы рака лёгкого, то для многих уже разработанных препаратов расширяют показания для применения – при наличии уже известных чувствительных к терапии мутаций, но в других типах опухолей. Таким образом, у врачей онкологов с каждым годом всё больше и больше терапевтический арсенал для лечения пациентов, а у нас генетиков всё больше мишеней для диагностики.

Злокачественная опухолевая эволюция в ходе лечения, разработка и использование новых терапевтических и диагностических подходов для помощи онкобольным напоминает гонку вооружений. Однако с каждой итерацией данного противостояния мы, онкологи, исследователи и пациенты, всё ближе и ближе к превращению некоторых форм рака из безусловно летального состояния в разряд хронического, пускай и тяжелого заболевания, что внушает большой оптимизм.

– То есть при резистентности для назначения следующей линии таргетной терапии требуется актуальный опухолевый материал?

– Да, зачастую это требуется. В таких случаях выполняют ребиопсию или при невозможности её проведения прибегают к жидкостной биопсии – получению плазмы крови пациента для анализа свободно-циркулирующей опухолевой ДНК.

Отдельная задача получить и исследовать резистентный материал опухоли пациента, который отвечал ранее на лечение, и найти эти мутации. Существует феномен гетерогенности, когда отдельные опухолевые клетки несут разные мутации. Какие-то клетки их могут содержать, какие-то нет. Наш опыт показывает, что мутация резистентности может содержаться в меньшем числе опухолевых клеток, чем исходная мутация. Поэтому её значительно сложнее выявить.

Также крайне важна доля опухолевых клеток в полученном образце. Если их мало, то ДНК неопухолевых «здоровых» клеток размывает картину и не позволяет найти искомую мутацию. То есть нередко нам приходится работать на грани чувствительности методов.

Существуют различные подходы, которые позволяют улучшить результат молекулярной диагностики. И как раз в нашей лаборатории мы занимаемся их изучением, разработкой и адаптацией таких подходов.
Ещё одна из проблем, которую нам пускай и не удалось полностью решить, но мы серьёзно снизили её вклад в нашу работу – это низкий уровень сохранности рибонуклеиновых кислот (РНК) в предоставленном материале.
Почему необходимо сохранить и получить РНК? РНК – одноцепочечная молекула, которая куда менее стабильна, чем двухцепочечная ДНК, однако именно она позволяет нам «заглянуть» в структуру белков, химерных транскриптов и оценить уровень активности интересующих нас генов. Для молекулярно-генетического исследования РНК из архивного образца должна быть преобразована в кДНК с помощью реакции обратной транскрипции. Однако по разным причинам РНК в образце может быть значительно деградирована и непригодна для анализа.
Решением данной проблемы занимается научный сотрудник лаборатории к.б.н. Наталья Владимировна Митюшкина. Её исследования позволили оптимизировать условия реакции обратной транскрипции для эффективного получения фрагментов кДНК, значимых для диагностических тестов, из образцов с низким уровнем сохранности РНК.
Таким образом, сейчас мы можем исследовать те образцы, которые ранее не могли быть проанализированы, что снижает необходимость в ребиопсии в таких случаях.

 – Вы говорили про первичную резистентность, можете рассказать о ней подробнее?

– Эффективность впервые назначаемой таргетной терапии при наличии молекулярных мишеней практически гарантирована, однако крайне редко может наблюдаться картина первичной резистентности.

Прежде чем перейти к более подробному обсуждению данной проблемы, мне необходимо сказать пару слов о существующих методах диагностики транслокаций.

• В основном для их выявления используют следующие методы (приведено упрощенное описание):Иммуногистохимия позволяет с помощью меченного антитела определить присутствие белка в клетке. По уровню и профилю окрашивания оценивают уровень экспрессии мишени, который коррелирует с наличием мутации. При раке лёгкого ИГХ могут использовать для выявления ALK, ROS1, RET-транслокаций.
• FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) – данное исследование позволяет детектировать перестройки на уровне хромосомной ДНК с помощью флуоресцентных зондов, понять, что произошел обмен участками хромосом.
• Молекулярно-генетические методы, среди которых обратно-транскрипционная ПЦР (ОТ-ПЦР). Данный метод позволяет выявить несбалансированную экспрессию концевых фрагментов перестраиваемых генов, например, для ALK и RET-транслокаций, а также путем тестирования отдельных вариантов перестроек. NGS-исследование – секвенирование нового поколения. Мы его используем в связке с ПЦР-методами для выявления крайне редких или новых, ранее не описанных вариантов перестроек.

По поводу первичной резистентности опухолей лёгкого к нам за последнее время было несколько обращений. У данных пациентов была выявлена транслокация методом FISH, однако ответа на лечение не наблюдалось. Сейчас мы активно занимаемся изучением данных случаев, однако предварительно можно предположить, что это связано с несколькими причинами:

• Транслокация присутствует только на уровне ДНК, то есть обмен между участками хромосом произошел, а на уровне РНК в химерном транскрипте появился стоп-кодон, который приводит к терминации (остановке) синтеза полипептидной цепи. В таком случае в опухоли отсутствует химерный белок (мишень), а обнаруженная мутация оказалась клинически незначима.
• Также возможна аналогичная ситуация, но при которой наблюдается другой тип мутаций – frameshift, приводящий к сдвигу рамки считывания, в результате которого все последующие аминокислоты перепутаны (не те, что должны быть).
• В опухоли исходно присутствуют генетические нарушения, приводящие к резистентности. Список возможных кандидатов весьма велик и в таких случаях также приходится прибегать к секвенированию нового поколения.
• Результат FISH-исследования некорректен и необходимо повторить анализ.

Всё это говорит нам о том, что такие случаи крайне сложны для изучения. Такие случаи единичны, но для их решения крайне важно использовать методы, позволяющие описать генетическое нарушение максимально подробно на молекулярном уровне.

– Какие ещё плюсы имеют подходы, используемые в вашей лаборатории?

– Молекулярная диагностика с каждым годом становится всё более доступной, выполняется всё больше генетических тестов. В связи с этим наиболее остро проявилась следующая проблема – нехватка опухолевого материала для проведения тестирования всех интересующих врача маркеров.

Особенно хорошо это видно на примере рака лёгкого. Наиболее распространенным способом забора материала является биопсия при бронхоскопии. Опухоли в таком материале крайне мало, и если выполнять все доступные ИГХ и FISH-исследования, то образец очень быстро расходуется, так как при каждом таком исследовании микротомом выполняются последовательные срезы, которые затем окрашиваются.

Молекулярно-генетические методы требуют меньшего объёма материала. Сейчас в нашей лаборатории мы можем при микродиссекции оценить процент опухолевых клеток и получить образец нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из крохотного фрагмента опухоли, при этом выполнить полный набор основных тестов для рака лёгкого – EGFR, ALK, ROS1, RET, MET, NTRK1-3, BRAF, KRAS и HER2, ещё останется образец для исследования других мутаций.

– На каком научном направлении вы собираетесь сфокусироваться в дальнейшем?

– Я планирую и дальше продолжать заниматься исследованиями молекулярно-генетических особенностей опухолей легкого. Более глубокое изучение механизмов резистентности, мутационного профиля таких случаев становится всё более актуальной задачей.

Также крайне важным кажется изучение генетических нарушений семейства генов FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor). Эти транслокации происходят по отличному от ALK, ROS1, RET механизму. В планах разработать методы их детекции, по возможности разработать скрининговые подходы. Это важно, потому что нарушения семейства генов FGFR встречаются в самых разнообразных опухолях. Например, перестройки гена FGFR2 – наиболее перспективная мишень для таргетной терапии холангиокарцином (опухолей желчных протоков). Это одна из самых тяжело поддающихся лечению опухолей, имеющая крайне ограниченное число терапевтических опций. В настоящее время активно ведутся клинические исследования перспективных таргетных препаратов к данной мишени, а диагностика данных нарушений практически недоступна в нашей стране.

– Что бы вы пожелали молодым специалистам, которые рассматривают для себя специализацию в области молекулярной диагностики и генетики онкологических заболеваний? У кого есть перспективы для развития в этой профессии?

– На базе нашей лаборатории выполняется достаточно большое число дипломных и курсовых работ, приходят студенты из биологических, медицинских и технических вузов. Мы предоставляем возможность поучаствовать в научной деятельности молекулярно-диагностической лаборатории, попробовать себя в этой сфере. Это направление сегодня интересно и популярно.

Условно говоря, есть анализ больших объёмов генетических данных (биоинформатика), а есть способ их получения – собственно это и есть лабораторная деятельность, когда ты работаешь руками и выполняешь все исследования сам. У нас можно попробовать, посмотреть, что больше нравится и что лучше получается.

При этом в нашей сфере много монотонной деятельности. Отдельное исследование, отдельный результат, отдельная задача – это пациент, его судьба. И это очень важно. Нужно уметь фокусироваться на рутинной работе. Хотя иногда и есть возможность чередовать ее с какими-то другими задачами, которые позволяют переключаться и оставаться в тонусе.

Молекулярная биология (генетика) рака – это область, находящаяся на стыке разных дисциплин. Можно сказать, в нашей лаборатории работает мультидисциплинарная команда специалистов: химиков, биохимиков, биоинформатиков, молекулярных биологов, генетиков, врачей-онкологов, инженеров и др.

Мы решаем уникальные, современные научные задачи, и у каждого сотрудника есть возможность оптимизировать процесс, существующие методики и применить это на деле.

Глоссарий:

• Амплификация гена – увеличение числа копий онконгенов, приводящее к их активации.

• Экспрессия – процесс преобразования последовательности нуклеотидов ДНК в функциональный продукт — РНК или белок, по уровню экспрессии можно судить о функциональной активности гена.

• Рамка считывания (frame) – последовательность нуклеотидов в составе ДНК или РНК, потенциально способная кодировать белок.

• Стоп-кодон – определённая тринуклеотидная последовательность (кодон) в мРНК-транскрипте, кодирующая остановку синтеза полипептидной цепи, стандартные стоп-кодоны: UAA, UAG, UGA.